1‌、降低冰點(diǎn)與抑制冰晶形成（冷凍保護(hù)）：‌

純水在0℃結(jié)冰，形成的尖銳冰晶會(huì)像刀子一樣‌刺穿‌微生物的細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和內(nèi)部結(jié)構(gòu)（如細(xì)胞器、DNA），導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

甘油是一種‌多羥基醇‌，溶于水后能與水分子通過(guò)氫鍵強(qiáng)烈結(jié)合。這干擾了水分子形成規(guī)則冰晶網(wǎng)絡(luò)的能力。

‌降低冰點(diǎn)：‌ 甘油溶液比純水在更低的溫度才會(huì)開(kāi)始結(jié)冰。

‌減小冰晶尺寸，抑制冰晶生長(zhǎng)：‌ 在冷凍過(guò)程中（無(wú)論是慢速冷凍還是快速冷凍），甘油的存在顯著‌減小了形成的冰晶尺寸‌，并使冰晶的結(jié)構(gòu)變得‌更圓滑、更小、更少‌。這大大降低了尖銳冰晶對(duì)細(xì)胞造成的物理?yè)p傷（機(jī)械損傷）。

‌促進(jìn)玻璃化（Vitrification）：‌ 在極低溫度下（如-80℃或液氮溫度-196℃），高濃度的甘油溶液傾向于形成一種‌玻璃態(tài)或非晶態(tài)固體‌，而非尖銳的晶體結(jié)構(gòu)。這種玻璃態(tài)就像極其粘稠的糖漿凍住了，沒(méi)有明顯的晶體邊界，從而最大限度地消除了冰晶損傷。

‌2、滲透壓緩沖（滲透保護(hù)）：‌

在冷凍過(guò)程中，細(xì)胞外的水分會(huì)首先凍結(jié)，導(dǎo)致細(xì)胞外溶液的‌溶質(zhì)濃度急劇升高（溶液變濃）‌，形成極高的‌滲透壓‌。

如果沒(méi)有保護(hù)劑，細(xì)胞內(nèi)水分會(huì)因滲透壓差被大量抽出（細(xì)胞脫水），導(dǎo)致細(xì)胞嚴(yán)重皺縮甚至死亡。復(fù)溫時(shí)，外部冰融化導(dǎo)致滲透壓驟降，水分又會(huì)快速涌入細(xì)胞，可能導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂（滲透性休克）。

甘油是‌可滲透性保護(hù)劑（Cryoprotectant Permeant - CPA）‌，這意味著它能夠緩慢地‌穿過(guò)大多數(shù)微生物的細(xì)胞膜‌進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。

‌平衡滲透壓：‌ 當(dāng)甘油進(jìn)入細(xì)胞后，它在細(xì)胞內(nèi)外都提高了溶液的濃度（降低了水活度）。在冷凍過(guò)程中，它有助于平衡細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的滲透壓，顯著‌減少了細(xì)胞脫水的程度和速度‌。這使得細(xì)胞在冷凍/解凍過(guò)程中體積變化更緩和，減輕了滲透壓變化帶來(lái)的壓力。

3‌、穩(wěn)定生物大分子與細(xì)胞膜：‌

‌氫鍵作用與水合作用：‌ 甘油分子上的羥基可以與蛋白質(zhì)、核酸、磷脂等生物大分子上的基團(tuán)（如氨基、羧基、磷酸基）形成氫鍵。這種相互作用有助于在冷凍脫水期間或低溫狀態(tài)下，‌穩(wěn)定這些大分子的三維結(jié)構(gòu)‌，防止其變性、沉淀或聚集。

‌維持膜流動(dòng)性：‌ 甘油被認(rèn)為可以插入細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層中，有助于在低溫下‌維持細(xì)胞膜一定的流動(dòng)性‌或防止其發(fā)生有害的相變（如從液晶態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟�膠態(tài)），從而保持膜結(jié)構(gòu)的完整性。

4‌、降低水活度：‌

甘油本身具有吸濕性，其大量羥基結(jié)合水分子，‌降低了溶液中的“自由水”含量‌，即降低了水活度。較低的水活度本身就不利于許多生化反應(yīng)和微生物活動(dòng)（即使在未凍結(jié)狀態(tài)下），這有助于在冷凍前和部分解凍狀態(tài)下保持菌種的穩(wěn)定性。

‌總結(jié)來(lái)說(shuō)，甘油在微生物冷凍保存中的作用是多方面協(xié)同的：‌

‌物理保護(hù)：‌ 抑制有害冰晶的形成和生長(zhǎng)，減少冷凍/解凍過(guò)程中的‌機(jī)械損傷‌。

‌滲透保護(hù)：‌ 作為滲透性保護(hù)劑，緩沖細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的劇烈變化，減輕‌脫水損傷‌和‌滲透性休克‌。

‌生化保護(hù)：‌ 通過(guò)氫鍵等作用穩(wěn)定蛋白質(zhì)、核酸和膜結(jié)構(gòu)，防止‌低溫變性和損傷‌。

‌降低水活度：‌ 創(chuàng)造不利于微生物活動(dòng)的微環(huán)境。

‌關(guān)鍵操作要點(diǎn)：‌

‌濃度：‌ 通常使用 ‌15-30% (v/v)‌ 的終濃度（常見(jiàn)20%-25%）。濃度過(guò)低保護(hù)不足；濃度過(guò)高可能因滲透壓過(guò)高或甘油本身的毒性導(dǎo)致細(xì)胞損傷。不同微生物對(duì)甘油的耐受性不同，需要優(yōu)化。

‌純度與無(wú)菌：‌ 必須使用‌高純度（如分析純或細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)）的無(wú)菌甘油‌。甘油通常通過(guò)高壓蒸汽滅菌（121°C, 15-20分鐘），注意甘油高溫下易變黃但不影響保護(hù)效果，關(guān)鍵是滅菌徹底。也可用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌。

‌制備：‌ 通常與菌懸液（處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，濃度較高）等體積混合，以達(dá)到最終所需的甘油濃度。確保甘油與菌液混合均勻。

‌冷凍速度：‌ 通常推薦‌緩慢冷凍‌（如使用程序降溫盒或置于-70℃至-80℃冰箱過(guò)夜后再轉(zhuǎn)移至液氮），讓甘油有足夠時(shí)間滲透入細(xì)胞并發(fā)揮保護(hù)作用。對(duì)于某些耐受性強(qiáng)的微生物，直接投入液氮?dú)庀嗷?80℃冰箱也可行。

‌儲(chǔ)存溫度：‌ ‌-80℃冰箱或液氮（-196℃）‌ 是最常用的長(zhǎng)期保存溫度。

‌避免反復(fù)凍融：‌ 解凍后應(yīng)盡快使用，避免多次凍融循環(huán)，每次凍融都會(huì)造成損傷累積。

‌與其他保護(hù)劑的比較：‌

‌DMSO（二甲基亞砜）：‌ 也是常用的滲透性冷凍保護(hù)劑，保護(hù)機(jī)理類似甘油。滲透速度通常比甘油快，對(duì)某些微生物效果更好，但對(duì)某些細(xì)胞類型毒性更大或有特殊氣味。

‌脫脂牛奶/海藻糖（凍干保護(hù)劑）：‌ 主要用于冷凍干燥保存（凍干法）。它們是‌非滲透性保護(hù)劑‌，主要通過(guò)在細(xì)胞外層形成保護(hù)性基質(zhì)、替代水分子穩(wěn)定大分子結(jié)構(gòu)等方式保護(hù)細(xì)胞。

‌甘油的優(yōu)勢(shì)：‌ 相對(duì)安全（低毒），價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)便，對(duì)大多數(shù)細(xì)菌、酵母、絲狀真菌都有良好效果，因此在微生物實(shí)驗(yàn)室冷凍保存中應(yīng)用最為廣泛。

總而言之，甘油通過(guò)其獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)（多羥基、滲透性、與水分子強(qiáng)相互作用），在微生物冷凍保存中起到了多重保護(hù)作用，有效防止了冰晶損傷、滲透壓損傷和低溫變性，使得微生物能夠在超低溫下長(zhǎng)期存活。